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Jun 12, 2023

Un metodo ad alto rendimento per la misurazione delle dimensioni delle uova in Drosophila

Scientific Reports volume 13, numero articolo: 3791 (2023) Cita questo articolo 735 Accessi 2 Citazioni 4 Dettagli metriche alternative I tratti della storia della vita sono usati come indicatori di fitness negli insetti, inclusi

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 3791 (2023) Citare questo articolo

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Dettagli sulle metriche

I tratti della storia della vita sono usati come indicatori di fitness negli insetti inclusa la Drosophila. La dimensione delle uova è un tratto adattivo ed ecologicamente importante, potenzialmente con variazione genetica tra diverse popolazioni. Tuttavia, la bassa produttività della misurazione manuale delle dimensioni delle uova ha ostacolato l’uso diffuso di questa caratteristica nella biologia evolutiva e nella genetica delle popolazioni. Abbiamo stabilito un metodo per la misurazione accurata ed elevata delle dimensioni delle uova di Drosophila utilizzando la citometria a flusso di particelle di grandi dimensioni (LPFC). Le stime delle dimensioni utilizzando LPFC sono accurate e altamente correlate con le misurazioni manuali. La misurazione delle dimensioni delle uova è ad alta produttività (media di 214 uova misurate al minuto) e le uova vitali di una dimensione specifica possono essere selezionate rapidamente (in media 70 uova al minuto). Lo smistamento mediante LPFC non riduce la sopravvivenza delle uova, rendendolo un approccio adatto per lo smistamento delle uova per le analisi a valle. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi organismo nell'intervallo di dimensioni rilevabili (10–1500 µm) dei citometri a flusso di particelle di grandi dimensioni. Discutiamo le potenziali applicazioni di questo metodo e forniamo raccomandazioni per ottimizzare il protocollo per altri organismi.

La dimensione delle uova è una caratteristica importante negli insetti che si sono evoluti in risposta a pressioni ecologiche e di sviluppo1. Le dimensioni delle uova e altri tratti della storia della vita (ad esempio la sopravvivenza, la longevità e la fecondità femminile) sono indicatori della forma fisica negli insetti. Nella Drosophila melanogaster, le dimensioni delle uova influenzano altri tratti della storia della vita, ad esempio la vitalità embrionale, il tasso di schiusa e lo sviluppo embrionale2, nonché caratteristiche morfologiche come il modello antero-posteriore dell'embrione3,4. L'affollamento larvale5 e fattori ambientali come la temperatura influenzano le dimensioni delle uova di D. melanogaster6,7,8. La dimensione delle uova di D. melanogaster aumenta con la latitudine in Australia e Sud America7, suggerendo che si tratti di un tratto adattativo in fase di selezione stabilizzante2. La Drosophila è uno degli organismi multicellulari sessuali più utilizzati nella biologia evoluzionistica. Questa popolarità è in parte dovuta al breve tempo di generazione della Drosophila e alla facilità di manutenzione in condizioni di laboratorio. Nonostante l'uso diffuso della Drosophila, la dimensione delle uova è raramente studiata negli studi evolutivi e di biologia delle popolazioni, in parte a causa della bassa produttività della misurazione manuale delle dimensioni delle uova.

Tradizionalmente, la dimensione delle uova veniva misurata osservandole al microscopio o allo stereoscopio2,7,8,9,10. In alternativa, le uova vengono fotografate al microscopio e le loro dimensioni vengono misurate manualmente dalle immagini3,4,11,12. Recentemente sono stati sviluppati alcuni strumenti di analisi delle immagini per calcolare automaticamente la dimensione degli oggetti13,14. I metodi che si basano su misurazioni manuali richiedono molto tempo e sono noiosi perché le uova devono essere trasferite manualmente e disposte nell'orientamento corretto prima di scattare le immagini. Anche la misurazione manuale delle dimensioni dell'uovo è soggetta a errori a causa della parzialità dello sperimentatore. Le fasi di analisi delle immagini richiedono inoltre che i campioni vengano fotografati su uno sfondo con colore e luminosità specifici13. Inoltre, le misurazioni manuali o gli strumenti di analisi delle immagini di solito non possono garantire il recupero di uova vitali che possono essere utilizzate per analisi a valle.

La citometria a flusso consente uno smistamento e una misurazione dimensionale rapidi e accurati di piccoli oggetti fino a 200 µm. Ma la dimensione media delle uova nel sottogruppo delle specie D. melanogaster varia da 400 a 600 µm4,5,8,9,10 che è troppo grande per essere elaborata con i tradizionali citometri a flusso. L'avvento della citometria a flusso di particelle di grandi dimensioni (LPFC) ha reso possibile la misurazione di oggetti vivi fino a 1500 µm. I sistemi LPFC funzionano a una portata più lenta e a pressioni inferiori rispetto ai tradizionali citometri a flusso per evitare forze di taglio distruttive. L'LPFC è stato utilizzato per l'analisi di organismi marcati con fluorescenza o transgenici, ad esempio uova di nematodi15, D. melanogaster16 e Anopheles gambiae17 e larve di coralli18. Gli oggetti etichettati non fluorescenti possono anche essere analizzati e ordinati su LPFC esclusivamente in base alla loro dimensione. Tuttavia, in assenza di etichettatura fluorescente, la forma degli oggetti influisce sull’accuratezza della stima delle dimensioni. Ad esempio, la forma dei semi di Arabidopsis è sferoidale prolato o cardioide19, quindi la misurazione delle dimensioni dei semi di Arabidopsis è quasi indipendente dall'orientamento dei semi20. Tuttavia, per oggetti con forme ellissoidali oblate o prolate come le uova di Drosophila, la dimensione stimata può variare a seconda dell'orientamento degli oggetti nel citometro a flusso. La dimensione dell'oggetto viene misurata correttamente solo quando gli oggetti sono orientati lungo il proprio asse ma può essere sottostimata se gli oggetti non passano lungo il proprio asse (Fig. 1A,B).